E2 泛素 （Ub） 偶聯(lián)酶主要確定 Ub 偶聯(lián)為 Ub-異肽（賴氨酸）、Ub-氧酯（絲氨酸/蘇氨酸）或 Ub-硫酯（半胱氨酸）。然而，細(xì)胞內(nèi)的 E2 特異性 Ub 偶聯(lián)曲線仍然難以捉摸。在這里，我們開發(fā)了融合 E2-Ub-R74G 分析 （FUSEP） 策略，以訪問具有氨基酸分辨率的細(xì)胞中的 E2 特異性 Ub 偶聯(lián)曲線。探針特異性亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸修飾的 Ub 殘余物能夠?qū)Ψ琴嚢彼?Ub 偶聯(lián)進(jìn)行系統(tǒng)研究，并提供位點(diǎn)特異性信息。發(fā)現(xiàn)多種 E2 酶參與非賴氨酸泛素化。使用 UBE2D3-Ub-R74G 探針進(jìn)行分析，在人 Cullin-1（Cullin-RING E3 Ub 連接酶的支架蛋白）中鑒定出翻譯后修飾，酪氨酸泛素化。這種修飾與賴氨酸泛素化不同。經(jīng)鑒定出單通道膜結(jié)合 E3 連接酶 RNF149 與 UBE2D3 配對(duì)，通過泛素化細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 ASC 來調(diào)節(jié)焦亡。該工具箱的推出為揭示 E2 特異性 Ub 偶聯(lián)譜和識(shí)別以前未知的 E3 Ub 連接酶以用于潛在的治療應(yīng)用鋪平了道路。